問(wèn)題一、什么是非洲豬瘟？

　　非洲豬瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine fever virus，ASFV)感染家豬和各種野豬(不傳染人)引起一種急性、出血性、烈性傳染病。其特征是發(fā)病過(guò)程短，最急性和急性感染死亡率高達(dá)100%，且只能依靠實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)確診。

　　2018年8月3日我國(guó)確診首例非洲豬瘟疫情。

問(wèn)題二、目前在中國(guó)的傳染范圍？

　　自8月初我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟以來(lái)，截至11月22日，全國(guó)有20個(gè)省份47個(gè)市(區(qū)、盟)發(fā)生73起家豬疫情、1起野豬疫情，累計(jì)撲殺生豬60萬(wàn)頭。全國(guó)非洲豬瘟疫情呈現(xiàn)多點(diǎn)散發(fā)狀態(tài)，但在各地動(dòng)物疾控部門的積極行動(dòng)下，疫情開(kāi)始趨于平穩(wěn)，總體防控有效。

問(wèn)題三、非洲豬瘟檢測(cè)的樣品處理方法介紹

一、非洲豬瘟樣品處理

1. 目的

　　規(guī)范ASFV樣品和實(shí)驗(yàn)材料的處理程序，保證ASFV相關(guān)實(shí)驗(yàn)的順序開(kāi)展和實(shí)驗(yàn)室的生物安全。

2. 適用范圍

　　適用于疑似ASFV臨床樣品的實(shí)驗(yàn)前的處理

3. 程序

3.1實(shí)驗(yàn)材料

　　ASF的易感動(dòng)物，主要為家豬、野豬和蜱，通常采集的樣品為家豬、野豬的血液樣品、組織樣品以及蜱三類。田間采集的樣品通常需要經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的預(yù)處理，才能進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)、診斷工作。

　　血清：用于病毒核酸檢測(cè)、病毒抗原和抗體檢測(cè)。將采好的豬血的注射器或采血管在室溫下傾斜靜止2~4h(防止暴曬)，或置于37℃溫箱內(nèi)1h，待大部分血清析出后，取出血清，必要時(shí)經(jīng)離心分離血清。(最低建議量5ml)。

　　抗凝全血：用于病毒核酸檢測(cè)和病毒抗原檢測(cè)。

　　采血前，在真空采血管或注射器內(nèi)按比例加入抗凝劑。采集血液，輕輕上下顛倒，使血液與抗凝劑充分混勻，防止血液凝固的同時(shí)避免溶血。也可以將血液放入裝有玻璃珠的滅菌瓶?jī)?nèi)，震蕩脫落纖維蛋白。必要時(shí)，可加入雙抗以抑制血源性或采血過(guò)程中可能出現(xiàn)的細(xì)菌污染。

　　當(dāng)血樣用于病毒核酸檢測(cè)時(shí)，一般不用肝素而選用EDTA作為抗凝劑。(最低建議量1mL)。

　　組織樣本：活體采集，采用扁桃體，用于臨床健康動(dòng)物ASF監(jiān)測(cè)。

　　尸體剖檢ASF發(fā)病動(dòng)物或死亡動(dòng)物經(jīng)解剖取材，包括：ASFV靶器官的采集：脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、扁桃體。

　　其他病變組織臟器的采集：采集具有明顯病變的肝臟、肺臟、心臟等組織器官，選取部位在病變和健康組織交界處。

　　腐敗動(dòng)物尸體的樣品采集：剖檢取股骨，將附著的肌肉和韌帶等全部剔除，采集骨髓。最低建議量5克。

　　蜱的采集：蜱可進(jìn)行核酸檢測(cè)、抗原檢測(cè)和蜱的形態(tài)學(xué)鑒定，查找豬圈的墻邊、墻縫、木質(zhì)或瓦質(zhì)的屋頂，或挖掘豬圈地面均可能找到蜱，也可查看豬表皮，采集蜱。

1-1樣品保存條件

注：用于病毒分離和病理學(xué)檢測(cè)的樣品禁止-20℃保存。

3.2實(shí)驗(yàn)器材和試劑

　　臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、組織研磨儀、水浴鍋、計(jì)時(shí)器、冰箱和移液器等。

　　無(wú)菌的剪子、鑷子、鋼珠、2mLEP管、移液器吸頭(10μL,200μL、1000μL)等。

　　其他試劑和耗材主要包括：0.01mol/L PBS(PH7.2)、0.8%NaOH、75%酒精棉球等。

3.3樣品處理程序

3.3.1血清及全血樣品處理

　　取血清或全血樣品1mL于滅菌EP管里，保存?zhèn)溆?/p>

3.3.2組織樣品處理

　　適用于脾臟等組織樣品和蜱的處理。盡可能減少污染，每取一個(gè)組織塊或蜱，用火焰消毒剪鑷等取樣器械，組織塊應(yīng)分別放入滅菌容器內(nèi)并立即密封，做好標(biāo)記，注意防止組織間相互污染。

    3.3.2.1組織樣品的處理應(yīng)在二級(jí)生物安全柜中進(jìn)行，勿使液體濺到生物安全柜中

　　3.3.2.2將0.1-0.2g組織塊放入2mLEP管中，用剪刀剪成碎塊，加1-2mL0.01mol/L PBS(PH7.2),再加入1-2粒滅菌鋼珠，密封后，表面消毒備用。剩余樣品放回容器內(nèi)，重新密封，表面消毒后保存-70℃冰箱。

　　3.3.2.3組織樣品的破碎可以利用組織研磨儀在生物安全柜外操作，將樣品制成組織懸液。

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3.4病毒滅活

　　病毒的滅活處理應(yīng)在二級(jí)生物安全柜中進(jìn)行，將處理好的血清、全血或者研磨破碎后的組織樣品連同EP管放入60℃水浴中，放置30min滅活。

3.5使用后儀器處理

　　剪刀、鑷子等均應(yīng)放入消毒缸進(jìn)行消毒，放入鐵飯盒內(nèi)，并裝入密封袋內(nèi)進(jìn)行高壓滅菌處理。裝有組織樣品保存液的容器和盛有組織塊的離心管應(yīng)密封管口，表面消毒后放入密封袋中高壓滅菌。鋼珠、吸頭等廢棄物應(yīng)用0.8%NaOH浸泡30分鐘消毒后，置密封袋內(nèi)高壓滅菌。消毒殘液應(yīng)裝入密封容器內(nèi)高壓滅菌處理。

3.6注意事項(xiàng)

　　操作之前要確認(rèn)生物安全柜和實(shí)驗(yàn)室已進(jìn)行了徹底的衛(wèi)生消毒處理，防止樣品間交叉感染。